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找出導致精子制動和死亡的原因

許多不孕不育症的原因都是在男方的身上。 而因為精子的問題造成不孕不育是其中常見的病因。

抗精子抗體就是精子的一個“毒物”。 他讓精子的品質變差, 導致精子不能和卵子結合, 孕育出生命。

抗精子抗體與精子結合後, 在補體參與下, 可導致精子制動和死亡, 利用台盼藍或伊紅Y 等染料使死精子染色, 間接驗證血清或分泌液中是否有制動精子的抗體存在。

一、台盼藍染色法

準備

1、待檢血清的分離和滅活補體。

2、AB血型人血清(補體)製備。

3、2%台盼藍液配製(用蒸餾水)。

4、台盼藍-生理鹽水溶液配製:取適量生理鹽水,

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加等體積2%台盼藍水溶液, 混勻即可。


找出導致精子制動和死亡的原因

5、配製0.01 mol/L, pH 7.4 PBS溶液。

方法

1、取正常新鮮精液[精子濃度為(40~ 100)×106/mL]用pH7.4 PBS作1∶10稀釋, 以500r/min 30min離心洗滌一次, 棄去上清, 沉渣用PBS調整精子濃度為100×106/mL 的精子懸液。

2、在小試管內加入1滴待檢血清, 1滴精子懸液和 2滴補體血清。 置37℃ 孵育, 並於30min、60min分別追加2滴補體血清, 直至90min後加入 1滴台盼藍生理鹽水溶液, 繼續孵育 60min, 取出小試管, 以500r/min, 30min離心, 棄去上清, 將沉渣塗片, 待乾燥後鏡下觀察。 以陰性血清作對照組, 以同樣條件和方法處理

3、計數:對照組:記錄數至100個無染色精子(活精子)時所需的總精子數(含100個無染色精子加一定數量染色的死精子)。 實驗組:記錄對照組相應的總精子數, 把其中所含的無染色精子(活精子)數作X。

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將100-X所得的數目, 即為被檢血致死的精子數, 這個數目稱為精子毒性指數(STI)。

判斷

STI>25時, P≤0.01, 判為陽性。 STI在 15~ 20之間, 判為可疑。 STI

二、伊紅Y染色法

準備

1、用蒸餾水配製4% 伊紅 Y 染液。

2、配製0.01mol/L, pH7.4 PBS溶液。

方法

1、取正常新鮮精液(精子濃度宜大於:60×106/mL), 用pH 7.4的 PBS洗滌 3次, 調整精子濃度為10×107/mL。

2、取精子懸液16μL, 移置載玻板的漆孔內, 分別設2個測定和對照孔, 另取待檢血清20μL, 補體血清4μL 加入測定孔內, 對照孔只加待測血清不加補體, 充分混勻。

3、把玻板移入濕盒內, 在37℃孵育30min, 每孔加4%伊紅Y 4μL, 加上蓋玻片使其作用 2min, 進行鏡檢。


找出導致精子制動和死亡的原因

判斷

由於活精子不著色, 死精子著染為紅色, 計算200個精子中, 死精子所占的百分數, 減去對照組死精子的百分數, 即為抗體殺滅精子的百分率。

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以殺滅精子≥10% 以上者為陽性。

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