鹼性磷酸酶(ALP)是成熟成骨細胞的標誌性酶， 同時成骨細胞形成的鈣結節也是成骨細胞的標記物。
以ALP為目標物的檢測方法有
1 Gomori鈣鈷法
2偶氮偶聯法
3鹼性磷酸酶染色試劑盒法。
4.PNPP偶氮法
5. BCIP/NBT比色法
6 茜素紅法
7. von Kossa法
1 Gomori鈣鈷法
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【染色原理】 ALP在pH值9.4的環境下， 以鎂離子作為啟動劑， 能夠把β-甘油磷酸鈉水解出磷酸， 磷酸與高濃度的鈣鹽結合形成無色的磷酸鈣， 再與硝酸鈷作用形成磷酸鈷， 經硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉澱在酶活性處。
【孵育液配製】 3%β-甘油磷酸鈉 5ml
2%巴比妥鈉 5ml
蒸餾水 10ml
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml
【步驟】
(1)將無菌的玻片放入培養皿中， 傳代時加入適量的細胞懸液， 作細胞爬片， 待細胞長滿玻片後取出。
(2)PBS沖洗後用冷丙醇固定10min， 蒸餾水沖洗數次。
(3)入孵育液中， 37℃孵育4-6h。 自來水沖洗數次。
(4)2%硝酸鈷中浸3-5min， 蒸餾水洗數次。
(5)1%的硫化銨中2min， 自來水沖洗， 自然乾燥， 封固。
【結果】胞質中陽性反應呈現灰黑色顆粒或塊狀沉澱。
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2 偶氮偶聯法
【孵育液配製】 萘酚AS-BI磷酸鹽 20mg
DMSO 0.5ml
0.2mol/L巴比妥醋酸緩衝液(PH 9.2) 50ml
六偶氮副品紅 0.5ml
1mol/L NaOH調PH 9-10， 混合後過濾使用。
(六偶氮副品紅：副品紅400mg， 濃鹽酸2ml， 雙蒸水8ml混合過濾;臨用前與等體積4%亞硝酸鈉混合)
【步驟】
(1)細胞爬片成功後， PBS沖洗後， 置入4℃ 10%甲醛固定10min。
(2)蒸餾水沖洗。
(3)將過濾孵液直接滴加於玻片上， 室溫下作用45min。
(4)流水沖洗， 晾乾。
(5)甘油明膠封固。
【結果】成骨細胞胞質中可見紅色ALP陽性顆粒。
3 鹼性磷酸酶染色試劑盒法
【作用原理】 細胞內鹼性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產生萘酚， 後者被重氮鹽捕獲， 生成不溶性有色沉澱。
4.PNPP偶氮法
【步驟】
(1)用吸管吸掉96孔板內的培養液， 用PBS沖洗3遍， 加入含25mmol/L二乙醇胺， 1mmol/L氯化鎂和6.7mmol/L PNPP的反應液。
(2)每孔150ul.37℃避光放置半小時,然後加0.1mol/L氫氧化鈉100ul終止反應,用酶標儀於405nm波長下測定OD值.
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(3)樣品OD值在ALP標準曲線上讀取酶活性值(U/L).
ALP標準曲線繪製:
取PNP0.0111克用三蒸水溶解後稀釋至250ml,此時PNP的濃度為320umol/L.依次稀釋到160 umol/L， 80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相當於ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶標儀於405nm波長下測定PNP的OD值.以ALP活性值作為引數,對應的OD值作為應變數,求得直線回歸方程.
【結果】測定鹼性磷酸酶的含量
5.BCIP/NBT比色法
BCIP/NBT (四唑硝基藍)是鹼性磷酸酶底物, 產物為深藍色, 在鹼性磷酸酯酶的催化下， BCIP被水解, 水解產物與NBT發生反應， 形成不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-formazan。
【步驟】
1. 在膜或組織切片， 最後一次洗滌完畢後， 加入適量BCIP/NBT染色工作液
2. 室溫避光孵育5-30分鐘或更長時間(可長達24小時)， 直至顯色至預期深度.
3. 用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應
4. 膜標本可乾燥後避光保存;組織切片或細胞樣品，
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【結果】有不溶性的深藍色物質出現
針對鈣沉積物“鈣結節”的染色方法
6. 茜素紅法
【步驟】
(1)培養皿用PBS沖洗2次， 95%乙醇固定10min， 雙蒸水沖洗3次。
(2)0.1%茜素紅-Tris-Hcl(PH 8.3)37℃， 30min。
(3)蒸餾水沖洗， 乾燥， 封片。
【結果】染料品種的不同， 礦化結節呈現不同的紅色。
7. von Kossa法
【步驟】
(1)培養皿用PBS沖洗2次， 4%多聚甲醛固定5分鐘， 雙蒸水沖洗3次。
(2)培養皿中加入5%硝酸銀溶液1ml， 將培養板開蓋在紫外燈下照射1小時。
(3)倒出殘留的硝酸銀溶液， 蒸餾水沖洗3遍。
(4)培養皿中加入5%硫代硫酸鈉溶液1ml， 中和殘留的硝酸銀溶液， 吸出殘液。
(5)室溫下晾乾， 封固。
【結果】鈣結節呈現清晰可見的黑顏色