鹼性磷酸酶（ALP）的檢測方法

鹼性磷酸酶(ALP)是成熟成骨細胞的標誌性酶，同時成骨細胞形成的鈣結節也是成骨細胞的標記物。

以ALP為目標物的檢測方法有

1 Gomori鈣鈷法

2偶氮偶聯法

3鹼性磷酸酶染色試劑盒法。

4.PNPP偶氮法

5. BCIP/NBT比色法

6 茜素紅法

7. von Kossa法

1 Gomori鈣鈷法

【染色原理】 ALP在pH值9.4的環境下，以鎂離子作為啟動劑，能夠把β-甘油磷酸鈉水解出磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結合形成無色的磷酸鈣，再與硝酸鈷作用形成磷酸鈷，經硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉澱在酶活性處。

【孵育液配製】 3%β-甘油磷酸鈉 5ml

2%巴比妥鈉 5ml

蒸餾水 10ml

2% CaCl2 10ml

2% MgSO4 1ml

【步驟】

(1)將無菌的玻片放入培養皿中，傳代時加入適量的細胞懸液，作細胞爬片，待細胞長滿玻片後取出。

(2)PBS沖洗後用冷丙醇固定10min，蒸餾水沖洗數次。

(3)入孵育液中，37℃孵育4-6h。自來水沖洗數次。

(4)2%硝酸鈷中浸3-5min，蒸餾水洗數次。

(5)1%的硫化銨中2min，自來水沖洗，自然乾燥，封固。

【結果】胞質中陽性反應呈現灰黑色顆粒或塊狀沉澱。

2 偶氮偶聯法

【孵育液配製】 萘酚AS-BI磷酸鹽 20mg

DMSO 0.5ml

0.2mol/L巴比妥醋酸緩衝液(PH 9.2) 50ml

六偶氮副品紅 0.5ml

1mol/L NaOH調PH 9-10，混合後過濾使用。

(六偶氮副品紅：副品紅400mg，濃鹽酸2ml，雙蒸水8ml混合過濾;臨用前與等體積4%亞硝酸鈉混合)

【步驟】

(1)細胞爬片成功後，PBS沖洗後，置入4℃ 10%甲醛固定10min。

(2)蒸餾水沖洗。

(3)將過濾孵液直接滴加於玻片上，室溫下作用45min。

(4)流水沖洗，晾乾。

(5)甘油明膠封固。

【結果】成骨細胞胞質中可見紅色ALP陽性顆粒。

3 鹼性磷酸酶染色試劑盒法

【作用原理】 細胞內鹼性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產生萘酚，後者被重氮鹽捕獲，生成不溶性有色沉澱。

4.PNPP偶氮法

【步驟】

(1)用吸管吸掉96孔板內的培養液，用PBS沖洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化鎂和6.7mmol/L PNPP的反應液。

(2)每孔150ul.37℃避光放置半小時,然後加0.1mol/L氫氧化鈉100ul終止反應,用酶標儀於405nm波長下測定OD值.

(3)樣品OD值在ALP標準曲線上讀取酶活性值(U/L).

ALP標準曲線繪製:

取PNP0.0111克用三蒸水溶解後稀釋至250ml,此時PNP的濃度為320umol/L.依次稀釋到160 umol/L，80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相當於ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶標儀於405nm波長下測定PNP的OD值.以ALP活性值作為引數,對應的OD值作為應變數,求得直線回歸方程.

【結果】測定鹼性磷酸酶的含量

5.BCIP/NBT比色法

BCIP/NBT (四唑硝基藍)是鹼性磷酸酶底物, 產物為深藍色, 在鹼性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解產物與NBT發生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-formazan。

【步驟】

1. 在膜或組織切片，最後一次洗滌完畢後，加入適量BCIP/NBT染色工作液

2. 室溫避光孵育5-30分鐘或更長時間(可長達24小時)，直至顯色至預期深度.

3. 用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應

4. 膜標本可乾燥後避光保存;組織切片或細胞樣品，顯色反應終止後，可以用中性紅複染染色

【結果】有不溶性的深藍色物質出現

針對鈣沉積物“鈣結節”的染色方法

6. 茜素紅法

【步驟】

(1)培養皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，雙蒸水沖洗3次。

(2)0.1%茜素紅-Tris-Hcl(PH 8.3)37℃，30min。

(3)蒸餾水沖洗，乾燥，封片。

【結果】染料品種的不同，礦化結節呈現不同的紅色。

7. von Kossa法

【步驟】

(1)培養皿用PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次。

(2)培養皿中加入5%硝酸銀溶液1ml，將培養板開蓋在紫外燈下照射1小時。

(3)倒出殘留的硝酸銀溶液，蒸餾水沖洗3遍。

(4)培養皿中加入5%硫代硫酸鈉溶液1ml，中和殘留的硝酸銀溶液，吸出殘液。

(5)室溫下晾乾，封固。

【結果】鈣結節呈現清晰可見的黑顏色